又是一年開學(xué)季，有的小伙伴剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，要投入忙碌而緊張的科研工作中了吧？
WB... 免疫組化... 免疫熒光...流式細(xì)胞...各種技術(shù)也是在勤學(xué)苦練當(dāng)中吧？
想學(xué)技術(shù)何必東奔西走，Bioss科學(xué)家早已經(jīng)把多年秘籍備好，準(zhǔn)備傾囊相贈(zèng)！
我們近期會(huì)連續(xù)介紹多種抗體應(yīng)用技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程和常見問題解決方案，你想要的全都有，持續(xù)關(guān)注本公眾號(hào)，獲取更多資訊，讓你的實(shí)驗(yàn)做得輕松愉快又標(biāo)準(zhǔn)！
開學(xué)季技術(shù)大講堂——（一）抗體相關(guān)基本知識(shí)
抗體(antibody)是生物體在抗原物質(zhì)刺激下，由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白(Ig)。按抗體的來源，可將其分為天然抗體和人工制備的抗體，是通過對(duì)特定生物體免疫接種特定抗原物質(zhì)后而獲得。人工免疫動(dòng)物制備的抗體應(yīng)用甚為廣泛，既可以用于科學(xué)研究，也可以用于疾病的預(yù)防、診斷和治療。
一、抗體的基本結(jié)構(gòu)
經(jīng)x線晶體衍射結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，抗體Ig由四條多肽鏈組成，各肽鏈之間由數(shù)量不等的鏈間二硫鍵連接。Ig可形成“Y”字型結(jié)構(gòu)，稱為Ig單體，是構(gòu)成抗體的基本單位。
（一）重鏈和輕鏈
天然Ig分子含有四條異源性多肽鏈，其中，分子量較大的兩條鏈稱為重鏈(heavy chain, H)，而分子量較小的兩條鏈稱為輕鏈(Light chain, L)。同一Ig分子中的兩條H鏈和兩條L鏈的氨基酸組成完全相同。
1. 重鏈分子量為50000～75000，由450～550個(gè)氨基酸殘基組成。重鏈恒定區(qū)的氨基酸組成和排列順序不同，其抗原性也不同。據(jù)此，可將抗體Ig分為5類(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE, 其相應(yīng)的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈，商品化的抗體絕大部分都是IgG。不同類的Ig具有不同的特征，如鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的數(shù)量和位置、結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度等均不完全相同。即使是同一類的Ig，其鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)量、位置也不同，據(jù)此又可將同類Ig分為不同的亞類(subclass)。
IgG的亞類
利用不同種屬動(dòng)物制備的IgG存在不同的亞類，常見的不同種屬IgG亞類如下：
? 兔: IgG（無亞類）
? 小鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3
? 大鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgM
? 山羊: IgG1, IgG2
在進(jìn)行某些抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)(如IF和FCM)的時(shí)候，我們常常需要仔細(xì)看一下所訂購(gòu)商品化抗體的IgG亞類，以方便我們選擇同型對(duì)照(isotype control) IgG (即與目的蛋白抗體相同來源種屬的相同類型正常IgG)作為抗體的陰性對(duì)照進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，以排除可能的非特異性染色結(jié)果。
2. 輕鏈分子量約為25000，由214個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。輕鏈可分為兩種，分別為kappa(κ)鏈和lambda(λ)鏈。據(jù)此，可將lg分為兩型(type)，即κ型和λ型，一個(gè)Ig分子上兩條輕鏈的型別總是相同的。生物體內(nèi)可同時(shí)存在κ型和λ型的Ig分子，不同種屬生物體內(nèi)兩型輕鏈的比例不同。正常人血清Ig的κ: λ約為2:1，而在小鼠則為20:1。根據(jù)λ鏈恒定區(qū)個(gè)別氨基酸的差異，又可將λ鏈分為λl、λ2、λ3和λ4四個(gè)亞型(subtype)。
（二）可變區(qū)和恒定區(qū)
通過分析不同Ig重鏈和輕鏈的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，重鏈和輕鏈靠近N端的約110個(gè)氨基酸序列變化很大，其他部分氨基酸序列相對(duì)恒定。因此，將Ig輕鏈和重鏈中靠近N端氨基酸序列變化較大的區(qū)域稱為可變區(qū)(variable region, V區(qū))，占重鏈1/4，占輕鏈1/2；將靠近C端的氨基酸序列相對(duì)穩(wěn)定的區(qū)域，稱為恒定區(qū)(constant region, C區(qū))，占重鏈3/4，占輕鏈1/2。
1．可變區(qū) 重鏈和輕鏈的V區(qū)分別稱為VH和VL。VH和VL中各含有3個(gè)氨基酸組成和排列順序高度可變的區(qū)域，稱為高變區(qū)(hypervariable region, HVR)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region, CDR), 包括HVR1(CDR1)、HVR2(CDR2) 和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)變化程度更高。VH的3個(gè)高變區(qū)分別位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而VL的3個(gè)高變區(qū)分別位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。VH和VL的3個(gè)CDR共同組成Ig的抗原結(jié)合部位(antigen binding site)，決定抗體的特異性，是抗體識(shí)別及結(jié)合抗原的部位。
2．恒定區(qū) 重鏈和輕鏈的C區(qū)分別稱為CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL長(zhǎng)度基本一致，但是不同類Ig的CH長(zhǎng)度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3, 而IgM和IgE則包括CHl、CH2、CH3和CH4。
（三）鉸鏈區(qū)
鉸鏈區(qū)(hinge region)位于CH1與CH2之間，富含脯氨酸，易伸展彎曲，從而改變抗原結(jié)合部位之間的距離，有利于抗體結(jié)合位于不同位置的抗原表位。鉸鏈區(qū)易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，產(chǎn)生不同的水解片段。
二、抗體的制備流程
利用生物體對(duì)抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體的機(jī)制，選用特定抗原物質(zhì)對(duì)機(jī)體持續(xù)刺激使其產(chǎn)生大量特異性抗體，之后收集純化得到針對(duì)特定抗原的特異性抗體，這一過程就是抗體制備?？贵w制備主要步驟包括：獲得理想免疫原、免疫動(dòng)物、分離血清、純化抗體和抗體應(yīng)用檢測(cè)，我們?cè)诖酥饕榻B獲得理想免疫原、抗體的克隆性和抗體純化的一些細(xì)節(jié)。
（一）獲得理想免疫原
制備抗體首先要獲得理想免疫原，通常免疫原可以是各種形式，不過理想的免疫原則需要進(jìn)一步的準(zhǔn)備。
1. 蛋白類抗原：對(duì)于天然易獲取的蛋白可以純化后直接作為免疫原；對(duì)于天然含量較少或難以提取的蛋白，可以通過基因工程重組表達(dá)的方式獲取。同時(shí)也可以選擇蛋白的特定的連續(xù)片段做多肽合成作為抗原，較短的多肽是半抗原，通常免疫原性較弱，需要進(jìn)一步偶聯(lián)載體蛋白(可選KLH、BSA、OVA)才能作為免疫原。
2. 小分子化合物：化合物抗原同樣是半抗原，也需要進(jìn)一步偶聯(lián)載體蛋白才能作為免疫原。為了便于偶聯(lián)載體蛋白，特定的化合物還需要進(jìn)行分子改造以便能成功偶聯(lián)。
3. 病原體：滅活的病毒或細(xì)菌可以直接作為免疫原。
免疫應(yīng)答過程
1. 抗原進(jìn)入機(jī)體
2. 抗原刺激 B淋巴細(xì)胞，使之分化增殖成為抗體分泌漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞（初次免疫應(yīng)答）
3. 抗體主要由漿細(xì)胞分泌
4. 記憶細(xì)胞再次受到特異性抗原刺激后會(huì)被激活而成為分泌抗體的漿細(xì)胞（再次免疫應(yīng)答）
5. 記憶B細(xì)胞是長(zhǎng)命細(xì)胞，可以存活數(shù)月甚至機(jī)體終生
抗原
是一類在適合條件下能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（抗體和效應(yīng)細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。
抗原具有兩種性能：
? 免疫原性( immunogenicity) : 指抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。
? 反應(yīng)原性( reactogenicity) : 指抗原分子與抗體或效應(yīng) T 細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)物發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。
抗原決定簇(antigenic determinant)
指抗原上那部分可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的具有特殊立體構(gòu)型和免疫活性的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)基團(tuán)，叫做抗原決定簇。由于抗原決定簇通常位于抗原分子表面，因而又被稱為表位(epitope)。
抗原決定簇決定著抗原的特異性，即決定著抗原與抗體發(fā)生特異結(jié)合的能力?？乖瓫Q定簇多位于蛋白質(zhì)的表面，一個(gè)蛋白質(zhì)大分子常有許多抗原決定簇?？乖瓫Q定簇依賴于氨基酸序列和空間構(gòu)象兩種因素，又分為線性決定簇(Linear determinants)、構(gòu)象決定簇(conformational determinants)和新生抗原決定簇(Neoantigenic determinant)。
?線性決定簇(Linear determinants): 又稱為順序決定簇(sequential determinants) 或連續(xù)決定簇(continuous determinants)，是抗原中直接由分子基團(tuán)的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列構(gòu)成的決定簇。
?構(gòu)象決定簇(conformational determinants): 又稱為不連續(xù)決定簇(discontinuous determinants)，是抗原中由分子基團(tuán)間特定的空間構(gòu)象構(gòu)成的決定簇，一般是由分子中不連續(xù)的若干肽鏈盤繞折疊而構(gòu)成。
? 新生抗原決定簇(Neoantigenic determinants): 通常是由于蛋白酶的切割活化以后才會(huì)出現(xiàn)的抗原決定簇，尤其是與一些蛋白和酶（如Caspase、insulin等）的加工和活化形式對(duì)應(yīng)。
（二）抗體的克隆性(Clonity)
一個(gè)抗原上可以有好幾個(gè)不同的抗原決定簇，因而使機(jī)體產(chǎn)生好幾種不同的抗體，最終產(chǎn)生出抗體是漿細(xì)胞。只針對(duì)一個(gè)抗原決定簇起作用的B細(xì)胞群或漿細(xì)胞群就是一個(gè)純系，純系的英文為Clone，音譯就是克隆。由一種B細(xì)胞群或漿細(xì)胞克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就象導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一種抗原刺激機(jī)體，也存在多種抗原決定簇，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體。
單克隆抗體和多克隆抗體產(chǎn)生區(qū)別示意圖
（三）抗體的純化
我們知道，一般免疫血清中含有特異性抗體和非特異性抗體，血清蛋白以及其他各種雜蛋白等，在制備特異性抗體過程中當(dāng)抗體的效價(jià)達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期之后，需要對(duì)免疫血清進(jìn)行純化提取得到效價(jià)更高，特異性更強(qiáng)，穩(wěn)定性更好的抗體。
目前，大多數(shù)商品化抗體使用Protein A或Protein G進(jìn)行純化。由于protein A或protein G 可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合。Protein A或protein G 作為配基可以被偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，當(dāng)抗血清從中流過時(shí)，特異性的IgG就與配基結(jié)合，其他雜蛋白則穿流而過。因兩種蛋白純化抗體時(shí)對(duì)不同宿主的抗體的結(jié)合能力不同，我們需要具體情況，分別選擇protein A 或protein G, 或者是protein A/protein G組合。一般兔抗（包括單克隆蛋白與多克隆抗體）、小鼠單抗IgG2a、IgG2b、IgG3, 選擇用protein A純化；而小鼠、大鼠和山羊的多克隆抗體、小鼠單抗IgG1、大鼠單抗，則選擇用protein G純化。
