石蠟包埋組織的免疫組織化學方案

1. 脫蠟水化

石蠟切片置于新鮮二甲苯中浸泡脫蠟3次，每次15 min；依次置于不同濃度（100%、95%、90%、80%、70%）乙醇浸泡各5 min，再置于蒸餾水洗滌5 min，重復(fù)3次。

2. 抗原修復(fù)

沸水浴修復(fù)：將100×抗原修復(fù)緩沖液（試劑2）用蒸餾水稀釋成1×抗原修復(fù)緩沖液，放入修復(fù)盒中并提前加熱至95-100℃（注意蓋好以防液體蒸發(fā)），然后將切片放入修復(fù)盒中，在沸水浴環(huán)境中保持外沸狀態(tài)15 min，室溫自然冷卻；用PBS緩沖液（試劑1，將干粉溶解在2L蒸餾水中）清洗5 min，重復(fù)3次。

3. 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶

用吸水紙吸去玻片上多余的液體，用免疫組化筆在組織周圍畫圈，加入2-4滴內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（試劑3），室溫下置于濕盒中孵育15 min，用PBS洗滌5 min，重復(fù)3次。

4. 血清封閉

用吸水紙吸去玻片上多余的液體，加入2-4滴封閉工作液（試劑4），置于濕盒內(nèi)37℃封閉20 min，以減少非特異性染色。

5. 一抗孵育

用吸水紙吸去玻片上多余的液體，加入2-4滴小鼠 Calbindin 兔多抗工作液（試劑5），置于濕盒中，4℃孵育過夜或37℃孵育1-2 h。

6. 復(fù)溫

4℃孵育過夜后，室溫下復(fù)溫15 min (若在室溫下孵育一抗，則直接進入下一步清洗)；用PBS洗滌5 min，重復(fù)3次。

7. 二抗孵育

用吸水紙吸玻片上多余的液體，加入2-4滴HRP標記羊抗兔IgG工作液（試劑6），置于濕盒中，37℃孵育1-2 h；用PBS洗滌5 min，重復(fù)3次。

8. 顯色

用吸水紙吸去玻片上多余的液體，在每張切片上滴加約50 μL新配制的DAB工作液（試劑7:試劑8:PBS=1:1:18），作用3-5 min。顯微鏡下觀察結(jié)果，達到合適的顯色強度后，用蒸餾水沖洗切片以終止反應(yīng)，用蒸餾水沖洗5 min，重復(fù)3次。

9. 復(fù)染

滴加適量復(fù)染試劑（試劑9）復(fù)染3-5 min，蒸餾水沖洗5 min，滴加鹽酸酒精分化約30 s，蒸餾水洗滌5 min，重復(fù)2次。

10. 脫水封片

將玻片依次置于不同濃度（70%、80%、90%、95%、100%）乙醇，各5 min；然后置于新鮮二甲苯中浸泡脫蠟3次，每次15 min。用吸水紙吸去多余的二甲苯，滴加適量封片劑（試劑10）在組織上，將蓋玻片蓋在組織上，避免產(chǎn)生氣泡。

注意事項

1. 建議檢測時進行陰性及陽性對照，以提高實驗的可靠性。

2. 本品中的配套試劑，請不要用其他生產(chǎn)商產(chǎn)品替換使用。

3. DAB為致癌物質(zhì)，請采取必要的防范措施。

4. PBS洗滌液（試劑1）配制后在4℃可保存一周；抗原修復(fù)液（試劑2）及顯色劑（試劑7和8）的工作液需每次實驗時現(xiàn)用現(xiàn)配。

*5. 發(fā)表論文時引用本產(chǎn)品的寫作建議 "IHC0106M, Bioss Antibodies"。引用示例: “Mouse tissue sections using Mouse Calbindin IHC Kit (IHC0106M, Bioss Antibodies) were stained for Calbindin according to the manufacturer's instructions.”